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产品目录

即用型PCR亚博体育怎么样(含染料)图片
产品货号:
BTN90805
中文名称:
即用型PCR亚博体育怎么样(含染料)
英文名称:
Instant PCR MasterMix
产品规格:
1ml×10|5mL×20
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品内含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂、上样染料等所有PCR所需要的成分,用户只需加入模板和引物即可进行PCR反应,具有广泛的用途。

产品特点:
1.扩增效率和灵敏度更高。
2. 方便,用户只需准备模板和引物既可以进行PCR实验。
3.快捷,操作步骤已经最大限度地简化,能减少污染,降低实验误差。
4.产物可直接用于T载体克隆,不需要额外的加A反应。
5.染料单独提供,方便客户组合。

储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期一年。

使用方法:(以30μL的标准PCR反应体系为例)
在一干净的PCR管中,加入下列成分:
试剂加入量
PCR MagicMix15μl
DNA模板(自备)哺乳动物基因组DNA0.5-1μg
酵母基因组DNA5-500ng
细菌基因组DNA0.5-50ng
质粒DNA5-500pg
PCR回收片段1-100pg
PCR引物(自备)10pmol each
补水到30μL

放入PCR仪中进行PCR,结束后取5-10μL直接上样电泳,按照1.0mL PCR MagicMix加入40μL专用染料的比例将40μL专用染料加入到1mL PCR MagicMix中
注意:
1.如果反应体系不是30μL,各成分需要等按比例增加或减少。
2.如果DNA模板中有PCR不明抑制物(植物、土壤和血液等DNA样品常含此类抑制物),可以在PCR体系中加入1/10的PCR抑制物清除剂(BTN60804,30μL体系中加3uL),可能会对PCR有帮助。

PCR反应的影响因素
变性温度与时间:模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃ 20~30秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热DNA聚合酶的活力,最高变性温度不宜超过95℃。
退火温度与时间:退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃,退火时间一般为30~60秒,足以使引物与模板之间完全结合,长时间退火没有必要。
延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增2 Kb片段,若使用Taq酶只需1分钟,使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现,时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
循环次数:可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素,设定20-40个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。
酶量:50μl反应体系可用0.5-5 U酶,酶量的选择与模板DNA的量,扩增片段大小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。
模板:模板可以是单链DNA,也可以是双链DNA,质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多,不超过1μg为宜,因为加量过多可能导致非特异性扩增增加,但是要考虑模板中靶序列的含量。例如,使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列,就需要适当加大模板用量。
引物:引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,最高不宜超过30个核苷酸,最佳长度为20~24个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5′端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构,如发夹结构。两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3′端。如果可能,引物3′端最好富有GC,这样退火后有利于引物3′端的延伸。人工合成的引物最好经过色谱层析纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2μm左右,浓度太高会导致非特异性扩增,太低则扩增产物太少。
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