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产品目录

即用型易错PCR亚博体育怎么样图片
产品货号:
BTN101005
中文名称:
即用型易错PCR亚博体育怎么样
英文名称:
Instant Error-Prone PCR Kit
产品规格:
100次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错PCR而开发。易错PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。

产品特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。易错PCR的突变率为0.66%(±0.13%),详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单,但如果在PCR引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4.可用于连续易错PCR,只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增1kb以下的产物,对于1kb以上的产物,建议分段扩增。

亚博体育怎么样组成:
成分规格
Taq DNA聚合酶(5U/μL)100μl
易错PCR Mix,10×300μl
易错PCR专用dNTP,10×300μl
MnCl2,5mM300μl
说明书1份


储存条件:低温运输,-20℃保存,有效期为一年。

使用方法:
1.以30μL的标准PCR反应体系为例,如果反应体系不是30μL,各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的PCR管中,加入下列成分:
易错PCR Mix,10×3μl
易错PCR 专用dNTP,10×3μl
MnCl2,5mM3μl
自备DNA模板(10ng/μL)1μl
PCR引物(自备,10μm each)10pmol each
Taq DNA聚合酶(5U/μL)1-5U
补水到30μl

2. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件,一般可以先尝试下面的PCR条件:
PCR前变性94℃ 3分钟
易错PCR94℃ 1分钟循环30次(见注)
45℃ 1分钟
72℃ 1分钟

注:易错PCR一般不需要热启动,也不需要在PCR结束后做延伸处理。

循环次数与突变几率的关系
易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率,进而决定每个PCR产物可能得突变位点数,所以所需循环数由客户根据需要改动。
PCR循环数每个碱基突变几率PCR终产物中的突变位点数
100bp200bp400bp800bp1600bp
50.00330.000.661.32.65.3
100.00660.661.32.65.311
200.0131.32.65.31121
300.0202.04.07.91632
500.0333.36.6132653

3.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。

疑难解答:
Q:易错PCR与定点突变PCR有什么区别?
A:定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的添加、删除、点突变等。它需要预先知道靶基因的序列。易错PCR是一种随机突变,它不需要预先知道靶基因的序列(引物结合部分除外),但需要后续的筛选方法筛选自己所需要的突变。
Q:易错PCR的错误率是多少?
A:易错PCR的突变率为0.66%(±0.13%),对500bp的PCR产物,相当于有4%的PCR片段为野生型,12%的含一个突变,20%的含两个突变,22%的含三个突变,18%的含四个突变,12%的含五个突变,12%的含六个或更多突变。
Q:如果需要每个核苷酸有高于0.66%的突变率,如何办?
A:可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但最好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮PCR。此外不能用少于千分之一的第一次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板,否则多样性将受到影响。第三轮易错PCR最好使用所有第二轮的PCR产物作为模板,但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。
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