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柱式动物线粒体DNA提取亚博体育怎么样(测序级)图片
产品货号:
BTN120501
中文名称:
柱式动物线粒体DNA提取亚博体育怎么样(测序级)
英文名称:
Animal mitochondrial DNA column extraction kit(Sequencing Grade)
产品规格:
15次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本亚博体育怎么样就是基于先纯化动物细胞线粒体、再从中柱式法纯化其DNA的两步法亚博体育怎么样。

亚博体育怎么样特点:
1. 即开即用,用户不需要自己配制各种溶液,优化各种条件。
2. 两步法,先纯化线粒体,再柱式法纯化其中的DNA,有粗提(mtDNA纯化前不用DNase处理线粒体)和精提(mtDNA纯化前用DNase处理线粒体)两套操作方案,适合于各种要求不同的后续实验。
3. 本产品一次可以处理约107×108个培养细胞,10mg培养细胞(相当于5瓶150 mm培养细胞)可以纯化到到0.2-0.5mg线粒体。
4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞,不建议用于动物实体组织。
5. 提供线粒体染液,可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

亚博体育怎么样组成:
成分规格备注
溶液A225ml配制匀浆液
蔗糖25.4g配制匀浆液
詹纳斯染色液1ml染色线粒体
溶液B0.5ml配制核酸酶反应液
DNase A干粉1mg酶切细胞核DNA
Benzonase(1U/μL)100μl酶切细胞核DNA
溶液C10ml纯化mtDNA
溶液D5ml纯化mtDNA
溶液E20ml纯化mtDNA
离心吸附柱15套纯化mtDNA
通用洗柱液15ml纯化mtDNA
DNA洗脱液10ml纯化mtDNA
人TPMT VNTR上游引物GCT CCG CCC TGC CCA TTT
下游引物GCC TCC GCC ACC AAT GAC
人线粒体HV2区上游引物GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C
下游引物CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A
说明书1份


储存条件:常温运输和保存,保存期限一年。

使用方法:
注意:线粒体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或冷室进行,所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却,否则线粒体容易破裂。

一:线粒体粗提
1. 称25.4g蔗糖到225mL溶液A中,盖上盖子后充分摇晃3~5分钟溶解即得250mL溶液A工作液,放冰上预冷待用。未用完的溶液A工作液需要-20℃保存,否则会长菌。
2. 如果是单层细胞,先用20mL PBS缓冲液洗涤107×108个培养的单层细胞,共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞,重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞,则1000g 4℃离心10分钟收集107×108个细胞,再用20mL PBS缓冲液洗涤2次,最后将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。
3. 用平甩转子(swinging-bucket rotor)离心机1000 g 4℃离心10分钟,吸弃上清,保留细胞沉淀。
4. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的溶液A工作液,轻柔重悬细胞。
5. 如果是成纤维细胞,由于其难于裂解,可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻,然后进入下步操作。如果不是,则直接进入下步操作。
6. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中(工作体积为10-15mL,间隙为0.12 mm,最好是玻璃材质,否则线粒体产率会降低)匀浆适当次数。细胞株不同,其最适匀浆次数不同,一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤,故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数,方法是每匀浆5-10次后,取2-3μl匀浆液到载玻片上,然后在相差显微镜下观察,完整细胞数量降低到20-50%以下为佳。
7. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核,上清液含线粒体。
8.转移上清液到离心管中,冰上放置待用。如有必要,可在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴一滴上清液到载玻片上,再滴入50μl詹纳斯染液染色20分钟,油镜下观察,蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
9. 用固定角度转子(fixed-angle rotor)离心机4℃ 10000 g离心10分钟,弃上清,所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
10. 用5mL溶液A工作液洗涤2次得线粒体粗提液(即重悬后,4℃ 10000 g离心10分钟,弃上清)。
11. 如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交,则直接进入第3部分mtDNA提取,也可以放-80℃长期保存待用。
12. 如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序,则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合,所以无论如何小心,粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染,如果不将其清除,高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。

二:线粒体粗提液中细胞核DNA的去除及鉴定
13. 将线粒体重悬于0.3mL溶液A工作液中,取10μl作为未处理对照。
14. 加入6μl Benzonase(1U/μL)溶液和30μl DNase A溶液(配法:将0.5mL溶液B加到装有1mg DNase A干粉的离心管中得到2mg/mL溶液,未用完的部分需要分装后放-20℃保存)。
15. 37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意:最好先预实验,每隔一段时间取10μl样品,灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增1-4个自选的VNTR位点和1-2个mtDNA基因(如vis或COII基因),检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为最佳。可从本公司另购细胞核基因和线粒体基因专一性引物。
16. 加入10μl自备的0.5M EDTA溶液(pH8.0)以终止酶反应。显微镜下检查线粒体完整性(见上节第8步)。
17. 用固定角度转子离心机4℃10000 g离心10分钟,弃上清。
18. 用1mL的溶液A工作液洗涤沉淀(即重悬后,4℃ 10000 g离心10分钟,弃上清。此为一次洗涤。)2次得到线粒体沉淀。

三:线粒体DNA提取
19.在不超过100μl的线粒体沉淀中加入600μl预热的溶液C到沉淀中,充分吹打均匀。
20. 再加入150μl(可称150-160mg)预热的溶液D到离心管中,颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
21. 65℃放置3~5分钟。
22. 加入200μl自备氯仿,震荡混匀10-30秒,此时溶液将呈乳白色。
23. 12000~15000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明,中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中,避免触及中间的白膜。
24. 加入1.5倍体积的溶液E,颠倒混匀后全部转移到离心吸附柱中,室温放置至少2分钟。
25. 12000rpm室温离心1分钟,弃收集管中的穿透液。
26. 通用洗柱液洗涤2次(将0.5mL加入离心柱中,12000rpm室温离心1分钟,弃穿透液,此为洗涤一次,再重复一次)。
27. 空甩半分钟去除残留液体,将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
28. 加30-50μl DNA 洗脱液,室温放置3~5分钟。
29. 12000rpm室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液。
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